產(chǎn)品簡介：
用 PCR 對 DNA 進行生物-素標記的原理是用帶生物-素標記的 dNTP 進行PCR 擴增，這些 dNTP 摻入到PCR 產(chǎn)物中之后，擴增得到的 DNA 片段自然就帶有生物-素標記，可以直接用于雜交試驗。本產(chǎn)品就是基于上述原理開發(fā)的。
產(chǎn)品特點：
1.一站式，本試劑盒經(jīng)過精心優(yōu)化，不需要用戶自己摸索標記條件。
2.優(yōu)化的生物-素摻入率，能有效降低探針中生物-素分子之間的可能空間阻礙，檢測效果佳。
3.得到的生物-素標記DNA 探針可以用于 Southern 雜交、Northern 雜交、原位雜交、菌落雜交和斑點印跡雜交等分析。
4.既可用于制備雙鏈DNA 探針，也可以用于制備單鏈 DNA 探針。
5.一次標記反應(yīng)可以得到μg 級的生物-素標記雙鏈 DNA 探針或約 700 ng
生物-素標記單鏈DNA 探針，足夠多次雜交實驗用。
6.本產(chǎn)品足夠 5 次生物-素標記 PCR 反應(yīng)(50 μL 體系)。
7.DNA 探針生物-素標記試劑盒(PCR 法)只能用于科研。
產(chǎn)品參數(shù)：
產(chǎn)品規(guī)格
成份規(guī)格包裝
標記專用PCR Mix(含酶)30 μL0.5 mL 紅蓋管
dNTP Mix，2.5 mM each25 μL0.5 mL 白蓋管
含 Biotin-11-dUTP 的
dNTP，2.5 mM each25 μL0.5 mL 綠蓋管
超純水1 mL1.5 mL 藍蓋管
使用手冊1 份無
保存和運輸
低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。
自備試劑
無
使用方法：
DNA 模板和模板專一性引物，常規(guī) PCR 反應(yīng)所需試劑，瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒。
一：準備工作
1.按常規(guī)的方法設(shè)計PCR 引物，使 PCR 產(chǎn)物(探針)長度在 400-800 bp
之間。過短則生物-素標記摻入少，探針雜交信號強度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強。
2.為保證成功率，最好先用常規(guī) PCR 產(chǎn)物制備 DNA 片段，再以之為模板進行標記PCR 反應(yīng)。不推薦以基因組 DNA 或其他背景復(fù)雜的 DNA 為模板直接進行 PCR 標記反應(yīng)。
二：用常規(guī)PCR 制備模板
3.用自備的 PCR 試劑盒按下表配置 50 μL 的常規(guī) PCR 反應(yīng)以制備標記
PCR 模板：
成份加入量
自備的 2×PCR Mix(含酶，含 dNTP)25 μL引物一和引物二(10 pmol/μL)各 5 μL
1 μg 基因組 DNA 或 1 ng 質(zhì)粒 DNA1 μL
超純水補到 50 μL
4.按引物 Tm 值設(shè)計的PCR 參數(shù)進行常規(guī)PCR。
5.用自備膠回收試劑盒回收常規(guī)PCR 產(chǎn)物并定量。膠回收步驟可以去殘留引物，避免這些引物干擾后續(xù)的標記 PCR 反應(yīng)。
三：標記 PCR 反應(yīng)
注意：由于雙鏈PCR 探針在雜交時變性的雙鏈彼此還會復(fù)性，降低雜交效率，因此強烈推薦使用單鏈標記 PCR。在設(shè)置標記 PCR 時必須做一個
常規(guī)PCR 對照(本試劑盒足夠 5 次標記 PCR 實驗)。
成份標記PCR常規(guī)PCR(自備)
標記專用PCR Mix(含酶)6 μL6 μL
含 Biotin-11-dUTP 的
dNTP，2.5 mM each5 μL不加
dNTP Mix，2.5 mM each不加5 μL
若雙鏈標記，加引物一和引物二；
若單鏈標記，只加一條引物
各 50 pmol
各 50 pmol
膠回收所得 PCR 產(chǎn)物10 ng(對雙鏈標記)
100 ng(對單鏈標記)10 ng(對雙鏈標記)
100 ng(對單鏈標記)
超純水補到 50 μL補到 50 μL
6.由于此步所用的 PCR 引物和第 3 步的 PCR 引物完-全一樣，故可以參考第 3 步PCR 參數(shù)進行標記 PCR，但需要進行下列修改：一是循環(huán)數(shù)增加到 35-55 個循環(huán)，使擴增得到的探針 DNA 片段參差不齊，雜交時這種DNA 能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，雜交效果比長度整齊的 DNA 更好；二是延伸步驟的時間增加 15 秒，因為標記 dUTP 摻入到DNA 的速度比常規(guī)的 dTTP 慢，增加延伸步驟的時間可以保證更多的標記 dUTP 摻入到合成的DNA 探針中；三是降低復(fù)性溫度 5-7℃，因為標記核苷酸摻入到 DNA 后，含標記核苷酸的 DNA 的 Tm 值將比正常的DNA 低。
7.PCR 結(jié)束后，取標記 PCR 反應(yīng)液和對照反應(yīng)液 3-5 μL 進行瓊脂糖凝膠
電泳(一定要使用濃度已知的 DNA marker)，檢測標記是否成功。由
于標記 DNA 含有額外的標記物、分子量更大，其泳動速度將慢于常規(guī)PCR 產(chǎn)物。下圖是一個典型的雙鏈標記 PCR 產(chǎn)物和常規(guī) PCR 產(chǎn)物電泳速度差異的比較圖：
標記的 DNA(右)與未標記的 DNA(左)電泳比較
8.探針的定量：電泳所用的DNA marker 濃度已知(如果不確定，可以問供應(yīng)商)，上樣體積已知，故上樣量已知，就可通過雙鏈探針 DNA 和DNA marker 對應(yīng)條帶的相對亮度來估計探針 DNA 濃度。例如，如果探針長度為 500 bp，而 marker 中 500 bp 這條帶的濃度是 10 ng/μL，共上樣 10 μL，則 500 bp 這條帶的上樣量為 100 ng。標記的探針 DNA在紫外下亮度只有它的一半，則探針 DNA 的上樣量為 100/2=50 ng， 如果上樣量是 5 μL，則探針的濃度是 50/5=10 ng/μL。但是，如果制備的是單鏈 DNA 探針，則不能按此法估計濃度，因為單鏈 DNA 結(jié)合核酸染料(如 EB 和 SYBR GreenI)的能力遠低于雙鏈 DNA。但可采用銀染法定量(跟marker 比較)。一般 100 ng 模板經(jīng)單鏈標記 PCR 擴增可得到 700 ng 左右的單鏈探針。
9.單鏈 PCR 標記產(chǎn)物可不經(jīng)純化直接加到雜交液中，雙鏈 PCR 標記產(chǎn)物需加熱到 95-100℃ 5 分鐘變性然后放冰上急冷后再加到雜交液中使用。
10.如果探針不立即使用，需要放-20℃長期保存，不能放常溫保存，否則 Taq DNA 酶的殘留的外切酶活性會降解探針 DNA。如果需要純化探針 DNA，請使用本公司的核酸探針純化試劑盒(排阻層析法)。
選擇我們的DNA 探針生物-素標記試劑盒（PCR 法），就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！
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