產品簡介：

本試劑盒采用E.coli polyA聚合酶對miRNA加尾，然后用特異引物進行逆轉錄，最后用熒光定量PCR試劑盒進行定量檢測，其原理示意圖如下：

產品特點：

1.兩步法（加尾-逆轉錄、染料法 qPCR），一步完成加尾-逆轉錄，然后檢測多個 miRNA 靶分子。一次加尾-逆轉錄反應得到的 cDNA 可以做上百次 PCR。

2.直接用總 RNA 為模板，不需要專門純化 miRNA，簡單快捷。

3.檢測靈敏度可以達到幾百個拷貝/反應。

4.能區分有 2-3 個堿基不同的 miRNA。

5.既可以定性，也可以定量。定量時線性范圍至少有 5 個數量級，但需要自備標準品。

6.既可以用總 RNA 為模板，也可以用總 miRNA 為模板。

7.用戶需要自備 miRNA 專一性的一條 PCR 上游引物。

8.本產品足夠 25 次 20uL 體系的加尾和逆轉錄反應，100 次 20uL 體系的染料法qPCR。

9.miRNA 染料法qRT-PCR試劑盒（polyA加尾法）只能用于科研。

產品參數：

成分規格包裝材料

加尾和逆轉錄 Mix

（含 dNTP 和 ATP）150 μL0.5mL 綠蓋管

miRNA-polyA RT 引物干粉0.5mL 本色管

E.coli polyA 聚合酶和

M-MLV 逆轉錄酶混合液40 μL0.5mL 紅蓋管

miRNA PCR 通用下游引物  干粉0.5mL 黃色管

2×SYBR PCR MasterMix1 mL0.5mL 棕色管

超純水1 mL2.0mL 藍蓋管

使用手冊1 份無

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

總 RNA、miRNA 專一性上游引物（5pmol/μL in 水中）

使用方法：

一、設計、合成和分析自備的 miRNA 專一性上游引物

1.本試劑盒需要用戶自行設計一條 miRNA 靶分子專一性的上游引物跟試劑盒提供的通用引物共同使用，用超純水稀釋到 5pmol/μL 待用。

2.miRNA 專一性上游引物的 Tm 值決定后續 PCR 的復性溫度，非常重要，故

必須準確。可以通過網上的在線分析軟件（如 oligoanalyzer）計算 Tm，但最好實驗測定，做法是將 100pmol miRNA 專一性上游引物和等量的互補引物

（不是下游引物）在 20μL 的本試劑盒提供的 2×SYBR PCR MasterMix 反應體系中混合（參考第 9 步，只是不加模板，其他成分都加），直接進行溶解曲線分析，測出在本試劑盒提供的反應體系中的 Tm 值。當軟件計算的 Tm 值和實驗測試的 Tm 值有差異時，以后者為準。

3.miRNA 專一性上游引物最好在 3 端比 miRNA 短幾個堿基。

4.可以選擇一個所研究物種的 5.8S rRNA 作為內參，設計一條 5.8S rRNA 專一性的引物，同時做平行實驗。

二、準備總 RNA

5.用自選方法和試劑純化總 RNA，測定其濃度，最后用超純水將其稀釋到100ng/μL。總 RNA 樣品中殘留的 DNA 污染由于并沒有下游通用引物

（miRNA-polyA RT 引物）的結合位點，所以一般不會干擾基于本方法的

miRNA PCR 檢測。

三、加尾及逆轉錄反應

6.按下表設置 RNA 加尾和逆轉錄反應，以 1 個樣品為例：

7.37℃保溫 1 小時。

8.加入 190μL 超純水使得總體積為 200μL（稀釋 20 倍），此樣品將作為 cDNA模板用于 PCR。未用完的 cDNA 20 倍稀釋樣品可以放-20℃至少兩年以上。

二、染料法 qPCR

9.按下表設置染料法 qPCR 反應，最好每個反應設置 3 個重復：

10.建議反應程序設置如下：

11.分析溶解曲線分析所得 Tm（在 70-80℃之間一般表示擴增是特異的），分析Ct 值，分析標準曲線的斜率和 R2（如果用陽性對照做了標準曲線反應的話）。

選擇我們的miRNA 染料法qRT-PCR試劑盒（polyA加尾法），就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！